一、MHC四聚体染色基本操作流程

（一）所需主要试剂和设备

（1）欲检测的细胞或全血；

（2）荧光染料标记Anti-CD8抗体或其它抗体；

（3）离心机、流式细胞分选仪等。

（二）基本操作流程

细胞准备

1）外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等，以2-5×10⁷/ml的密度重悬于FACS Buffer（PBS+ 2%小牛血清+0.1%叠氮钠；建议使用时新鲜配制），制备成细胞悬浮液。

2）取25ul细胞悬浮液滴加入微孔培养板或FACS试管。

Staining Cocktail制备

3）制备2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC四聚体（建议稀释比例为1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释）。

染色孵育

4）取25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤2中的微孔培养板或FACS试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）

5）在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育60 分钟。

洗涤

6）加入150ul FACS Buffer至微孔培养板每孔或2-3ml FACS Buffer至FACS试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm离心5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器，轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）

7）重复步骤6，再洗涤2次。

细胞固定&流式分析

8）将细胞重悬于200ul固定液（PBS+1%多聚甲醛（PFA））中，使用流式细胞仪进行样本分析。

二、MHC四聚体染色注意事项

（1）染色体系的体积应尽可能小，以节约试剂。例如：25ul 2X Staining Cocktail + 25ul细胞悬浮液=50ul。

（2）所有操作应尽量在4℃条件下进行。一些MHC四聚体在室温或更高温度条件下，能获得更高强度的亲和力，可提高染色效果。但另一些细胞表面标志物，比如CD62L，对较高的温度条件往往比较敏感。部分MHC四聚体已被证实，在37℃条件下容易与细胞解离。故我们建议：在4℃条件下孵育45-60分钟，或在室温条件下孵育30分钟。

（3）在进行大规模试验前，建议先进行预试验，以确定最佳的MHC四聚体稀释比例。通常，建议MHC四聚体的初始稀释比例为1:100～1:200。请根据具体实验，优化其稀释比例，以期获得最佳的染色效果。

（4）对于新鲜的外周血单核细胞、淋巴细胞、脾细胞，通常建议每个染色样品细胞总数为1-2 ×10⁶；而对于细胞克隆或者CTL细胞系，每个样品细胞总数可减低为2×10⁵。当针对细胞克隆染色时，建议选取具有不同特异性的其它克隆细胞作为阴性对照。